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雙熒光素酶實驗的原理是利用熒光素酶與底物結合發生化學發光反應的特點，把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上游，構建成熒光素酶報告質粒。然后轉染細胞，適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。同時，為了減少內在的變化因素對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因的質粒作為對照質粒與報告基因質粒共轉染細胞，提供轉錄活力的內對照，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。常應用于啟動子轉錄活性調控及miRNA靶基因驗證等方向研究。